| <colbgcolor=#2cb431><colcolor=#fff>{{{#!wiki style="margin: -10px" | <tablebordercolor=#2cb431><tablewidth=100%> | [[유전체 편집| 유전체 편집 ]]Genome Editing | }}} | ||
| 기반 | 현상 | 센트럴 도그마(복제 / 전사 / 번역) | |||
| 물질 | 핵산 / 단백질 / 뉴클레이스(효소) | ||||
| 기술 | 중합 효소 연쇄 반응 / DNA 수선(V(D)J 재조합) | ||||
| 1세대 편집 | ZFN | ||||
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| 3세대 편집 | RGEN(CRISPR 시스템) | ||||
| 유전체 편집이 모든 것을 바꿀 것이다. - 크리스퍼(CRISPR) [1] |
1. 개요
크리스퍼 (CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템은 세균 등에서 발견되는 적응 면역 기작으로, 현재는 이를 응용한 유전체 편집 기술인 3세대 유전자 가위(RGENs, RNA-guided engineered nucleases)로 더욱 잘 알려져 있다.초창기의 크리스퍼는 단순히 DNA를 절단하기 위해 사용되었다. 그 뒤 크리스퍼는 사람 유전체에 완전히 새로운 DNA 절편이나 유전자 전체를 삽입하여 기존의 유전정보를 다른 것으로 바꾸기 위한 기술로 개발하는 과정에 있다. 이러한 기술이 개발된다면 크리스퍼는 유전 질환 외 다른 건강 문제를 치료하는 데에도 널리 사용될 수 있다. 관련기사
종래의 유전체 편집 기법에 비해 월등하게 간편하고 저렴하며, 정확하게 유전체 편집을 가능하게끔 해 '유전공학의 혁명'이라고 불리고 있다. 특히 원하는 유전자를 정확히 찾아내서 이를 쉽게 잘라내는 방식은 생명공학자들에게 새로운 유전자 수술용 메스를 쥐어준 셈이나 마찬가지. 1980년대 분자생물학과 생명공학에 대혁신을 일으킨 유전자 증폭 기술에 맞먹는 대혁신이라고 할 수 있다. 간단한 예로 기존의 연구방법으로는 2년 정도 걸리던 실험을 크리스퍼 시스템을 이용하면 1주일로 단축시킬 수 있다고 한다. #
여기서 크리스퍼(CRISPR)란, 세균의 유전체에서 발견되는 독특한 염기서열로, 'clustered regularly interspaced short palindromic repeats'의 약자이다. '규칙적인 간격을 갖고 나타나는 짧은 회문 구조의 반복 서열'이라는 뜻[2].
크리스퍼 시스템에는 여러 종류가 있는데 아래에서 설명한 내용은 주로 CRISPR-Cas9 시스템에 중점을 두고 서술되어있다.
2. 소개
2.1. 발견
세균의 유전체 내에 크리스퍼 서열이 존재한다는 사실이 1987년 일본 규슈대학의 이시노 요시즈미(石野 良純)박사에 의해 발견되었으나#, 당시에는 이 서열이 세균의 어떤 생명 활동에 관여하는 지는 밝혀지지 않은 상태였다. 2007년에 들어서야 이 서열이 세균의 적응면역에 관여한다는 사실이 밝혀졌는데, 이를 밝혀낸 건 놀랍게도 덴마크의 요구르트 회사에서 일하던 과학자들이었다. #요구르트 배양에 필요한 유산균은 박테리오파지라는 바이러스에 매우 취약해, 유산균 배양조가 파지에 감염되면 유산균들이 떼죽음을 당하기 일쑤였다. 이에 과학자들이 죽은 유산균들 사이에도 꿋꿋이 살아있는 유산균들을 연구한 결과, 유산균이 크리스퍼 시스템을 이용해 파지의 침입에 내성을 갖게 되었다는 사실을 밝혀낸 것이다. 그 원리를 간략하게 설명하면 다음과 같다.
- 취득 단계 : 박테리오파지와 같은 바이러스가 세균에 침입하면, 세균은 이들의 DNA 일부를 잘라, 자신의 유전체 중 '크리스퍼 부위(CRISPR loci)', 그 중 반복 서열 사이의 스페이서 부위에 삽입한다.
- 발현 단계 : 동일한 바이러스가 다시 침입하면, 세균은 Cas 단백질을 발현함과 동시에, 스페이서와 상보적인 서열의 RNA(crRNA)를 발현한다.
- 절단 단계 : crRNA-Cas 복합체가 형성된 상태에서, crRNA가 바이러스 게놈 내 상보적인 서열과 결합하면, Cas 단백질이 바이러스의 DNA를 절단함으로써 바이러스를 죽인다.
고등 생명체에게만 있던 것으로 알려진 적응 면역이 박테리아 단위에도 존재한다는 사실은 놀라운 사실이었지만, 시간이 지나면서 점차 크리스퍼에 대한 관심이 줄어들고 있던 중, 2012년 <사이언스> 지에 제니퍼 다우드나 박사팀이 논문 하나를 발표하였다. #
crRNA의 서열 중 일부를 바꿔주기만 하면, 크리스퍼 시스템을 원하는 DNA 서열을 자르는 '유전자 가위'로 사용할 수 있다는 파격적인 내용의 이 논문이 발표되자마자 크리스퍼 시스템은 유전체 편집 기술로서 엄청난 화제를 불러일으키며, 이를 활용한 다양한 기술들이 개발되기 시작했다. 사르팡티에와 다우드나는 이 업적을 인정받아 2020년 노벨화학상을 수상했다. 업적을 세운 후 노벨상을 받을 때까지 수십 년이 걸리는 게 일반적인데, 논문 발표 후 10년도 채 지나지 않아 수상을 했다는 것은 그 발견이 그만큼 혁신적이었다는 뜻이다.
2.2. 세부 기작
CRISPR-Cas9 시스템이 목표 DNA 서열을 자르는 데에는 크게 세 가지 단계를 거쳐 이뤄진다.- DNA 감시 복합체(DNA surveillance complex) 형성 : 세포 내에서 Cas9 단백질과 crRNA가 발현되면 목표 DNA 서열을 찾기 위한 복합체를 형성한다. 사실 Cas9와 crRNA가 복합체를 이루기 위해선 tracrRNA라 불리는 RNA 조각이 추가적으로 발현되어 crRNA 내 반복 서열과 상보적인 결합(crRNA-tracrRNA duplex)을 이룬 상태여야만 한다. 하지만 crRNA와 tracrRNA의 말단을 서로 연결해 하나의 단일 RNA(single guide RNA, sgRNA)로 만들어 발현시켜도 정상적으로 크리스퍼 시스템이 작동하므로 실험실에서는 주로 sgRNA를 사용한다.
- 목표 서열 인식 : 목표 DNA를 인식하는 sgRNA의 서열은 약 20-nt로, 전체 유전체에서 이와 상보적인 서열이 있을 확률은 1/4^20이다. 이때 무작정 sgRNA와 DNA가 상보적인 결합을 한다고 해서 Cas9이 활성을 가지는 것이 아니라, Cas9은 sgRNA가 상보적으로 결합하는 DNA 서열 근처에 'PAM(Protospacer-Adjacent Motif)'라 하는 염기 서열이 있어야만 활성을 가질 수 있다. 예를 들자면, 실험에 주로 사용하는 Streptococcus pyogenes Cas9(Sp Cas9)의 PAM 서열은 5'-NGG-3'로, 만약 크리스퍼 시스템을 이용해 유전체 편집을 하려면 5'-NGG-3' 근처에 위치한 서열을 목표로 sgRNA를 디자인해야 하는 것이다. PAM 서열은 박테리아의 종류마다 차이가 있기 때문에[3] 목표 서열 근처에 PAM 서열이 없다면, 다른 박테리아의 Cas9를 사용하면 된다.
- 목표 서열 절단(DSB) : Cas9 단백질에는 HNH와 RuvC라는 두 개의 뉴클레이스(nuclease) 도메인을 가지고 있는데, 목표로 하는 DNA 서열에 Cas9이 결합하면 이 두 도메인이 목표 DNA의 이중 가닥을 각각 한 가닥씩 자르게 된다[4].
- DNA 수선 : 절단된 DNA는 DNA 수선(DNA repair)이라는 기작을 통해 편집이 이뤄진다. 절단된 부위를 단순히 이어붙이는 비상동말단결합(Nonhomologous end joining, NHEJ) 기작으로는 유전자를 녹아웃시킬 수 있고, 상동 재조합(Homologous recombination)의 얼개인 동형방식수선(Homology Directed Repair, HDR)을 통해 유전자 단일 가닥 일부를 없애, dna polymerase와 수선 단백질로 교정하거나 삽입할 수도 있다.
이와 같은 크리스퍼 기술은 생산은 물론 활용도 간단해 작은 연구실에서도 생산할 수 있다. 당시 유전체 편집 기술의 단점으로 꼽히던 자원집약적 특성[5]에서 벗어났기 때문에 더 많은 연구실들이 유전자가위에 접근할 수 있고 이로인해 세계 과학의 경쟁면에서 공정성이 상당히 높아지는 효과를 기대할 수 있다고 한다.
이런 유전체 편집 기술은 무엇보다도 원하는 목표 DNA 서열만 자르는, 다시 말해 엉뚱한 데를 자르는 'off-target'을 줄이는 것이 매우 중요하므로, RNA 서열을 바꿔보거나, Cas9 단백질 외 다른 단백질을 사용해보는 등 크리스퍼 시스템의 정확도를 높이고자 하는 연구가 많이 이뤄지고 있다.
3. 종류
크리스퍼 시스템은 해당 기작에 관여하는 Cas 단백질의 종류가 여러 개(class 1)인지, 단일(class 2)인 지에 따라 2개의 클래스(class)로 나뉘는데, 두 클래스는 다시 유전체 상 CRISPR-cas 위치(loci), 작용하는 Cas 단백질의 종류에 따라 여섯 가지 타입(I–Ⅵ)으로 세분화된다. 그 중, 주로 현재 유전체 편집에 주로 사용되는 CRISPR-Cas9 시스템은 클래스 2 중 타입 Ⅱ에 해당한다.3.1. 클래스 1
3.1.1. Type I
클래스 1의 타입 I 시스템은 DNA를 타겟으로 삼는 복합체인 캐스케이드(Cascade)와 endonuclease 인 Cas3로 이루어져 있다. 캐스케이드는 PAM 서열에 대한 비교적 자유로운 결합으로 인해 상당히 유연하게 타겟에 결합할 수 있다. Cas3은 타겟 DNA에 단일 가닥 손상을 형성하고, 그 이후에 exonuclease 활성을 통해 서열을 제거한다. 이러한 활성을 조절하여 특정한 박테리아에 넣어주었을 경우, 원하는 박테리아만 선택적으로 사멸시킴으로써 항-박테리아 기능을 가질 수 있음이 보고되었다. 이런방식으로 원하는 박테리아만 선택적으로 죽이는 것은 기존의 항생제에서는 불가능한 일이었기 때문에 Cas3를 이용한 차세대 항생제의 가능성이 최근 주목되고 있다.
3.1.2. Type III
Cas10을 제한효소로 쓰는 크리스퍼 시스템. 타입 III의 경우 DNA와 RNA를 모두 타겟으로 삼을 수 있다는 점에서 특이하다. 서브타입의 수는 다른 뷰류 보다 적은 편.3.1.3. Type IV
존재가 비교적 불확실한 카테고리이다.3.2. 클래스 2
3.2.1. Type II
Cas9은 클래스 2 타입 II에 속하는 CRISPR 시스템으로 현재까지도 가장 널리 사용되고 있다. 특히, 위에도 언급되었듯이 세균의 한 종류인 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)에서 발견된 SpCas9이 원핵세포 밖에서 사용된 가장 첫 사례이며 발견이후 포유동물 세포에도 빠르게 적용되었다. DNA 타겟을 인지하고 나서 SpCas9은 끝 부분이 평평한 DSB (이중 가닥 손상, double strand break)를 만든다. Cas9의 특정한 부분에 돌연변이를 만들면 타겟 특이성이 향상되어 오프-타겟 효과가 줄어든다. sgRNA의 이차 구조를 변형하여 온-타겟과의 결합을 향상시키기도 했으며, 이런 노력으로 초기 Cas9 보다 효율이 좋은 방식으로 개선이 이루어지고 있다.3.2.2. Type V
Cas12a는 Cpf1으로도 알려졌다. Cas12a는 클래스 2 타입 V에 속하는데, 타겟 사이트에 5’ 오버행을 만들어 끝 부분이 어긋난 형태로 DNA를 절단한다는 점에서 Cas9과 차이점이 있다.활성을 위해 tracrRNA를 필요로 하는 Cas9 단백질과 달리, Cpf1은 그저 crRNA만 있어도 정상적으로 작동하며(즉, crRNA와 tracrRNA를 하나의 sgRNA로 만드는 과정이 필요 없다.), 절단부위도 유전체 편집에 유용한 점착 말단(sticky end)으로 잘라주고, off-target도 적기 때문에 Cas9을 대체할 단백질로 '3.5세대 유전자 가위'라 불리며 연구되고 있다.
Cas12a는 Cas9에 비해 Editing 효율이 상대적으로 낮은 편이고, 실제로 연구도 훨씬 덜 진행되었다. 하지만 영리 목적의 사용을 위해 엄청난 개런티를 지불해야 하는 Cas9과는 달리, Cas12a는 상대적으로 적은 개런티로 사용이 가능하기 때문에 크리스퍼의 상업적 이용을 목표로 하는 회사들의 연구가 진행 중이다. 때문에 크리스퍼 관련 학회에 간다면, Cas9으론 별거 아닌 주제들을 Cas12a로 성공하였다는 내용의 포스터를 발표하는 회사 관계자들을 자주 볼 수 있다.
3.2.3. Type VI
Cas13을 핵산중간분해효소(endonuclease)로 하는 크리스퍼 시스켐. 클래스 2에 해당하는 크리스퍼 시스템 가운데 유일하게 RNA만을 편집한다. Cas13은 자연적으로 RNA를 인지하여 자를 수 있으므로 인위적으로 ssRNA를 자르도록 조작된 Cas9인 RCas9과는 유사한 기능을 하지만 기본적으로 이 둘은 다르다. 렙토트리치아 와데이(Leptotrichia wadei)에서 발견된 Cas13a와 프레포텔라(Prevotella)에서 발견된 Cas13b가 대표적이다.4. 응용
이 기법이 나온 이래로 이를 응용한 실용적인 연구결과들이 쏟아져 나오고 있다. 각종 동물이나 식물의 형질 개량이나 질병 치료나 해충 퇴치에도 응용되고 있고 벌써 인간 배아의 유전체를 편집하는 실험도 진행되고 있다. #, #연구자들이 전문적인 지식 없어도 크리스퍼 유전자 가위를 보다 쉽게 사용할 수 있게 하기 위한 크리스페타(CRISPETa)라는 소프트웨어까지 등장했다. #
4.1. dCas9과 유전자 특이적 조절
Cas9 뉴클레이스 도메인 내에 돌연변이가 발생하면 목표 DNA 서열에 결합해도 서열을 절단하지 못하는데, 이를 이용해 두 개의 도메인을 돌연변이시켜 목표 DNA에는 결합해도 절단을 하지 못하는 dCas9(nuclase-deactivecd Cas9))으로 만들 수 있다.이렇듯 DNA를 손상시키는 능력을 갖지 못하고 인지능력만 가진 dCas9을 활용하여 여러가지 유전자 특이적 조절을 수행할 수 있다. 가령 dCas9에 여러 단백질을 이어붙인 키메라 단백질을 만들어, 특정한 유전자의 발현을 조절하거나(CRISPRa/CRISPRi), 형광 단백질을 붙여 유전체 영상화(Genomic Imaging)를 구현하는 등 단순한 유전체 편집을 넘어서 다양한 기술에 응용되고 있다.
4.1.1. 크리스퍼 간섭
dCas9이 DNA에 결합하는 것만으로 RNA 중합 효소를 물리적으로 방해함으로써 전사 억제 효과가 발생하는데 이를 크리스퍼 간섭이라고 한다.4.1.2. 크리스퍼 활성화
dCas9을 반대로 전사 활성화 단백질에 결합함으로써 CRISPR 활성화로 불리는 방식으로 사용하는 것도 가능하다4.1.3. 후성 유전체 교정(Epigenome editing )
dCas9을 기반으로 한 기술로 유전자 자체의 염기서열을 변경할 뿐만 아니라 유전자 활성에 영향을 줄 수 있는 DNA의 화학적 변형 배열을 포함한 '후성유전체'를 변경하여 유전자가 발현되는 방식을 바꿀 수 있다.사실 후성 유전체를 표적으로 하는 기술은 그동안 염기 교정만큼 빠르게 발전하지 못했다. 그 이유 중 하나는 세포 분열이 이뤄지면 기존에 수정한 후성유전체 정보가 무효화 될거라는 인식이 있었기 때문이다. 하지만 후성 유전체 교정의 효과가 생각보다 오래 지속된다는 것이 밝혀지면서 상황이 반전되었으며 후성 유전체 교정 유전자 가위는 각광받는 새로운 필드로 자리매김하고 있다.
DNA 자체의 염기를 변경하지 않는 대신 DNA에 부착되어 유전자의 활동을 조절하는 메틸기를 추가하는 방식으로 최소 11개월의 효과를 얻은 연구도 보고가 되었다.#
이런 후성 유전체 교정 기법은 몇 주 혹은 몇 달에 한 번씩 다시 투여해야하는 RNA 기반 약물에 비해서도 강점을 가지고 있다는 점에서 귀추가 주목된다.
4.2. nCas9과 염기교정(base editing)
한 편 두 개의 도메인을 돌연변이 시켜 dCas9을 만들지 않고, 한 도메인만 돌연변이 시키면 한 가닥만 자르는 nickase(nCas9)[6]를 만들 수 있다.염기교정 유전자가위는 DNA 한 쪽 가닥을 자르는 Nickase Cas9(nCas9)과 시토신을 분해하는 탈아미노효소(cytitdine deaminase)3)로 구성되어 있다. nCas9으로 잘려진 DNA 한 가닥에서 탈아미노효소가 시토신(C)을 우라실(U)로 바꾸면, 우라실(U)로 바뀐 염기는 DNA 복구 과정에 의해 티민(T)이 되는 원리로 작동한다.
염기 교정이 처음 보고된 이후 7년 동안 연구자들은 염기 교정 과정에서 야기되는 의도치 않은 DNA 편집의 가능성을 줄이고 염기 교정 가위의 구성 요소의 크기를 줄여 인간 세포에 더 쉽게 전달될 수 있도록 하는 방법을 개발해 왔다.염기 교정 기법은 이미 2023년 지금 시점에서 고콜레스테롤혈증과 백혈병 치료제를 포함한 초기 임상시험에서 사용되고 있는 중이다. 그러나 염기교정은 유연하지 못하다는 단점이 있는데, 상당한 정밀도에도 불구하고 특정 DNA 서열만 변경하는 데 사용할 수 있고 게놈에 DNA 덩어리를 삽입할 수 없다는 점이 단점으로 꼽힌다.
4.3. 프라임 교정(prime editing)
2019년 11월에는 Cas9와 역전사 효소를 이어붙인 키메라 단백질을 이용해, 단순히 DNA 서열 상 특정 위치를 찾아서 절단하는 것 뿐만 아니라, 다른 DNA 서열을 삽입하는 '프라임 편집(prime editing)'이라는 기술도 개발되었다. Cas9 단백질이 가이드 RNA를 따라 표적 DNA 서열을 찾은 뒤 해당 부위를 절단하면, 역전사 효소가 뒤이어 RNA를 주형으로 상보적인 DNA 서열을 합성하는 방식으로 이뤄지는 방식이다. #Prime Editing은 타겟으로 하는 pegRNA, 역전사 효소에 더불어 Reverse Transcriptase(=역전사 효소) Template을 넣어주는데 이로 모든 종류의 유전자 교정이 가능하다(이와 Cre-loxP 시스템을 응용하여 더욱 큰 유전자 조각를 넣어주는 방법도 성공했다#). 생물체에 따라 다르긴 하지만 동식물의 경우 HDR보다 효율이 높고, Base Editing보다 자유로운 유전자 교정이 가능하다.
5. 활용 사례
2017년 11월 15일, 미국에서 최초로 사람 몸에 유전자 편집 시술을 시행했다. #2023년 10월 에든버러 대학교 연구진은 크리스퍼 기술을 활용해 세계 최초로 조류인플루엔자에 강한 닭을 만들어내는 데 성공했다는 논문을 발표했다.# 해당 바이러스를 증식시키는 DNA를 잘라내거나 변이를 일으키는 방식을 쓴다. 콧구멍에 고의로 바이러스를 넣었는데도 10마리 중 한 마리만 감염되었다고 한다. 2년 이상 건강상태를 관찰한 결과, 특별한 후유증도 없었다고 한다. 닭의 폐사를 줄이며 축산물 시장의 공급상 변동성을 줄일 수 있기 때문에 식산업에 큰 영향을 줄 수 있을 것으로 예상된다.
CRISPR을 사용한 치료제도 이미 시중에 나와있다. 2023년 12월, 버텍스 파마슈티컬과 크리스퍼 테라퓨틱스가 공동 개발한 낫적혈구질환 체외 CRISPR 교정 치료제인 엑사셀이 FDA 승인을 받았다.[7] 가격은 환자 당 200만 달러.# 영국 등 타 국가의 허가기관에서도 순조롭게 시판허가를 받고 있던 상태였다.
6. 사건 사고
2018년 11월 26일, 중국의 연구자 허젠쿠이의 동영상에서 그가 CRISPR를 통해 인간 유전자를 편집하였고 아이가 태어났다는 것이 알려졌다. # 요약하자면 한 부부가 아이를 낳고 싶었는데 남편이 HIV 보균자였다. 하지만 아이에게 HIV 바이러스를 물려주고 싶지 않았기에 이러한 실험이 진행되었다. HIV 바이러스는 T세포의 리셉터인 CCR5를 통해 T세포 내부로 들어가는데 이 실험에서는 CRISPR을 통해 그 수용체를 날려버려 HIV의 감염 자체를 차단했다. 그리고 유전자가 편집된 11개의 배아를 자궁에 집어넣어 쌍둥이가 태어났다.해당 연구자에 따르면 출생 이후 유전자 검사를 실시하였고 정확히 원하는 부분만 잘 편집되어 아기들은 문제가 없다고 주장하고 있다. 다만 자연적으로 존재하는 돌연변이와 다른 새로운 CCR5 변형 유전자가 발생되었으므로 HIV의 감염을 제대로 막을 수 없을 것이라는 의견도 있다. 또한 CCR5가 신경발달과 관련 있는 수용체라 뇌 발달에 결함이 생길 수 있다는 의견도 있다. 아직 정식 논문이 나오지 않았기에 사실 확인은 정확히 안 됐지만, 많은 학자들이 분노와 우려를 표하고 있다. 결국 중국 당국은 법에 따라 처리하겠다는 입장을 밝혔고, '유전자 편집의 생식 목적 사용 금지'에 관한 법률을 위반했다고 판단하여 허젠쿠이를 소속 대학에서 해고, 기타 연구자들을 조사했다. #, # 재판 결과 허젠쿠이 교수는 3년 징역형과 벌금형을 받았다.
2023년, 출소한 허젠쿠이가 아이들의 근황을 밝혔는데 잘 살고 있다고 한다. #
7. 참고
7.1. AI 머신러닝 기술과의 접목 (OpenCRISPR-1)
크리스퍼 유전자 가위의 기작이 본래 세균 또는 고세균에서 발견된 만큼, 동식물에 적용시 이를 최적화 시키려는 연구가 많이 진행되어 왔다. 이와 같은 맥락으로 AI 머신러닝 기술을 통해 크리스퍼에 가장 흔하게 사용되는 Nuclease인 Cas9 단백질을 인공 합성시킨 OpenCRISPR-1에 대한 연구가 진행되었다. 크리스퍼가 미래의 유전병등을 치료할 기술로 각광받고 있는 만큼, 사람 시스템에 최적화 된 Cas9 단백질을 합성 시키는것을 목표로 하고 있다. 해당 논문에 근거하면 이렇게 인공적으로 합성된 DNA 염기서열을 가진 Cas9 단백질은, 이미 존재하는 Native 상태의 Cas9 단백질과 동등하거나 그 이상의 효율을 보였다고 한다.##8. 둘러보기
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[1] 쿠르츠게작트의 영상.[2] 후술하겠지만, 반복 서열 사이사이에 삽입된 '스페이서(spacer) 서열'은 세균에 침입한 바이러스의 DNA 서열 일부를 가져 온 것이다.[3] 예를 들자면, Staphylococcus aureus의 Cas9(Sa Cas9)은 PAM 서열로 5'-NNGRRT-3'를 인식한다.[4] HNH 도메인이 crRNA와 상보적인 DNA 가닥(target strand)을, RuvC 도메인이 그 반대 가닥(non-target strand)를 절단한다[5] '2세대 유전자 가위'라 불리던 ZFN, TALEN 등의 기술은 시간은 물론 돈이 엄청 많이 들었기 때문에 일반 실험실에서는 꿈도 못 꾸던 기술이었다. 사실상 제한효소 외엔 선택지가 없었던 셈.[6] DNA를 절단할 때는 절단면에 따라 점착, 평활 말단(sticky/blunt end)으로 구분되는 데, 두 개의 nCas9를 활용하면 중간에 DNA를 삽입하기 편리한 sticky end로 만드는 데에도 활용할 수 있다.[7] 크리스퍼 테라퓨틱스는 2020년 노벨 화학상 수상자인 에마뉘엘 샤르팡티에가 공동설립한 기업이다.