High Performance Liquid Chromatography
고성능 액체 크로마토그래피.
1. 설명
일반 크로마토그래피와 마찬가지로 이동상과 고정상에 대한 밀접한 차이를 가지는 구성물질들로 이루어진 혼합물을, 구성물질간의 이동 속도 차이를 이용해 분리해내어 분리한 물질을 검출기를 통하여 검출해 내는 장치. 일반 크로마토그라피와 다른 점이 있다면, 일반 크로마토그래피는 삼투압이나 중력을 이용하여 이동상(mobile phase)과 구성물질을 이동시킨다면, HPLC는 pump를 이용해 가하는 압력으로 구성물질을 이동시킨다는 것이다.또한 그냥 육안으로 관찰하는 일반 크로마토그라피와는 달리 UV detector등의 다양한 detector를 이용하여 용질을 확인하는 것도 차이점.
대표적인 제조사로는 미국의 Agilent, Waters 독일의 Sykam, 일본에는 JAI, Hitachi 그리고 오사카 소다 정도가 있다. 비교적 분석 장비중에서 개발된지 오래됐고 가격이 싸면서 구조또한 단순하기 때문에 많은 정밀분석장비 제조사들이 제조하며 그 성능도 상향평준화된지 꽤 됐다.
현대에 접어들어 실험 및 실용 과학이 중요시 되면서 눈부신 발전을 이륙한 대표적인 분석 장비다.
다양한 파생작들[1]이 있으며 어느 실험실, 연구실을 가봐도 최소 한두대는 항상 돌아가고 있는 장비다.
2. 사용법
Column안에 정제된 혼합물이 삽입되면, 혼합물 안의 구성물들은 고정상(stationary phase)과의 상호작용 때문에 column 안을 다른 속도로 이동하게 된다. 특정 분석물이 column을 완전히 통과하는데 걸리는 시간을 머무름시간 혹은 retention time이라고 칭한다. 동일한 분석 조건(기계적 상태, 온도, 염도 등등)하에 동일한 물질의 retention time은 항상 동일하다고 여긴다.column 내의 고정상들은 레진이라고 하는 물질들로 대게 bead형태로 이루어져 있으며, 이 bead의 입자가 작을수록 column의 분리능[2]이 좋아지며 이론단수[3]가 높아진다. 다만 작은 입자 크기로 인해 밀도가 증가해 필연적으로 column 및 기계 전반적으로 걸리는 압력이 기하급수적으로 증가하기 때문에 무조건 작은 사이즈의 충전물[4]이 좋다고 하긴 어렵다. 일반적으로 고정상의 종류에 따라 순상(Normal Phase, NP, 고정상이 극성인 경우), 역상 (Reverse-Phase, RP, 고정상이 비극성인 경우)로 구분되므로, 분석물의 물성에 대한 이해를 기반으로 순상 컬럼을 사용할 것인지, 역상 컬럼을 사용할 것인지 선택하게 된다.
대부분의 이동상은 수용성 용매로 물이 주로 쓰이고, 그에 대칭되는 유기용매로써 메탄올이나 아세토나이트릴이 많이 쓰인다. 수용성 용매에는 혼합물이 서로 분리되는 것을 돕기 위해 염이나 산[5]을 약간씩 넣어주는 경우가 많다. 분석 시간 도중 이동상의 조성 변화의 유무에 따라 종류가 갈리는데, 일정한 이동상 조성비를 가진 분리를 등용매 분리( isocratic separation), 이동상의 조성비가 변하는 분리인 구배 분리(gradient elution mode)로 구분된다.
등용매 분리는 대체적으로 분석시간이 길고, 머무름 시간이 늘어지며 크로마토그램 뒤쪽으로 갈수록 분석자가 영향을 주기 어려워 진다.[6]하지만 분석법이 단순하며 한번 안정화 되면 오랜시간 사용가능해 안정성이 높으며 주로 검정기관에서 사용한다. 반면, 구배 분리는 용리력이 이동상의 조성비에 의해 결정되기 때문에 분석자가 크로마토그램 전체 부분에 영향을 주며 특정 부분만 영향을 줄 수 있으며 기계적 성능이 떨어져도 구배분리를 정밀하게 설정해주면 극미량의 분석물도 분리해낼 수 있다. 단점으로는 분석방법 밸리데이션에서 문제가 생길 수 있으며 사용자의 높은 지식을 요구하며 Isocratic 시스템보다 구배분리 시스템의 가격이 더 비싸다는 점[7]이 있다. 일반적으로, 구배 분리는 역상 컬럼을 사용할 때 적합한 것으로 알려져 있으며, 순상 컬럼을 사용하는 경우 권장되지 않는다.
보통의 gradient elution mode는 역상크로마토그래프에서 아세토나이트릴 5%에서 시작해 95%까지 늘리는 방법을 사용한다.
3. 검출기
3.1. UV
물질의 농도에 따라 빛의 투과성이 변화하는 램버트 비어의 법칙을 이용하여 ppm 범위로 용액 내 성분의 양을 측정한다. 흡수파장은 물질마다 차이가 있기 때문에 HPLC를 통해 뭘 분석하느냐에 따라 어떤 파장의 빛을 사용할지가 결정된다. UV검출기는 단일파장 혹은 지정된 몇 개의 파장만을 측정하는 흡광도 검출기(VWD, MWD)와 지정된 범위의 스펙트럼을 스캔하는 DAD로 분류한다. 보통 정량분석에 이용하지만, UV스펙트럼은 물질 고유의 특성이기 때문에 검출된 성분과 표준물질의 UV스펙트럼을 비교하여 정성분석도 어느정도는 가능하다. 정성분석을 진행하는 경우, 대체로 DAD 검출기의 지정 범위 스펙트럼의 저장 기능을 이용하여 각 물질 피크의 고유 흡수 스펙트럼을 분석하는 방식으로 정성분석을 진행한다. 이 때, Method 에서 지정한 파장이 아닌 다른 파장의 스펙트럼을 추출하는 기능 또한 지원되는 경우가 있다.3.2. FLD
물질에 특정파장을 조사했을 때 특정 파장을 방출하는 형광현상을 이용하여 물질을 검출하는 검출기이다. UVD에 비해 선택성과 감도가 뛰어나지만, 분석가능한 물질이 형광물질에 한정되는 단점이 있다. 때문에 컬럼에서 분리된 성분을 형광 유도체 화 한 후 검출하는 방법등을 이용하기도 한다.3.3. 전기전도도 검출기
이동상에 녹아있는 이온들의 양에 따라 전기전도도가 변하게 되는데, 이 변화하는 전기전도도를 전극을 이용하여 검출하는 것으로 이온의 양을 검출하는 검출기이다. 보통 검출기에 온도보정이 이루어져 재현성이 매우 뛰어나다. 이온크로마토그래프의 검출기.3.4. RID
굴절률 검출기라 한다. 농도에 따라 발생하는 굴절률 차이를 이용하여 물질을 검출하는 검출기로서, 흡광도로는 분석할 수 없는 고분자나 당 등의 분석에 이용된다. 원리적 특성상 용액의 농도가 지속적으로 변하는 기울기 용리는 사용이 불가능한 단점이 있다. 이 단점을 해소하기 위해서 시료를 에어로졸화 하여 이동상을 증발시킨 후 시료성분에 의한 산란현상을 이용하는 ELSD 등의 검출기 등도 있다.
3.5. ELSD
증기화 광산란 검출기라고 한다. 이동상에 열을 가해 기화시켜 흩뿌린 뒤 레이저를 쏴 산란되는지를 측정한다. 매우 뛰어난 감도를 가지고 있지만 시료의 휘발성이 강하면 사용하기 힘들며 검정기관에서 인정을 잘 안 해준다. 그리고 가격이 무지막지하다.3.6. MS
질량분석기라 한다. 시료를 기체화 하여 이온으로 만든 뒤 자기장 속에서 가속하여 해당분자의 질량대 전하 비를 측정한다. 이온화 과정에서 분자는 여러개의 조각이온으로 박살이 나는데, 이 조각이온의 패턴은 물질 고유의 특성이기 때문에 표준물질과의 비교를 통하여 정성분석과 ppb단위의 정량분석이 동시에 가능하다. 또한 원하는 질량의 분자만을 선택적으로 검출하기 때문에 uvd등의 검출기에 비하여 선택성도 매우 뛰어나다.4. 종류
4.1. Partition chromatography
가장 기초적인 chromatography. 흡착/탈착 현상으로 물질을 분리하는 paper chromatography나 thin layer chromatograhy 와 달리, 이동상과 고정상 사이의 용해도 차이에 의해 발생하는 RT값의 차이를 이용하여 물질을 분리한다. 아래에 있는 역상크로마토그래프가 이에 해당한다.4.2. Reversed phase chromatography
비극성의 고정상과, 극성(예를 들어 물 과 같은)의 이동상을 사용한다. 가장 흔한 고정상은 silica로 이루어진 파티클에 알킬기등이 붙어있는 형태로서, 이 알킬기가 비극성의 용매처럼 작용하여 분리하고자 하는 성분들이 이동상과 고정상간의 용해도 차이에 의하여 고정상에 용해되었다가 이동상에 용해되었다가 하며 성분들을 분리한다. 이런 고정상에서는 구성물질의 retention time은 극성이 낮을수록 늘어난다.이 크로마토그라피의 장점은 retention time을 늘려 정밀도를 늘리고 싶을 때, 이동상에 물만 부어주면 된다는 것이다.
4.3. Size exclusion chromatography
혹은 gel chromatography. gel[8] 사이의 공간으로 혼합물 내의 구성물질들이 통과하며, 구성물질의 분자 크기에 따라 구성물질들의 서로 다른 retention time을 가진다. 보통 낮은 정밀도를 가지고 있어서, 추가적인 크로마토그래피를 할 때 가끔 사용되는 정도. 그리고 단백질을 변성시키지 않고 분리하거나 3차, 4차 구조를 알려 할 때 유용한 방법이다.4.4. Ion exchange chromatography
요약하면 IC. retention time은 이동상의 이온과 고정상의 charged site(대전된 부위) 사이의 attraction에 따라 결정된다. 이동상의 charge가 고정상과 같으면 retention time이 짧아지고, 다르면 길어진다. 양이온등의 금속이온 검출은 훨신 더 빠르고 감도도 좋은 AAS나 ICP등이 있기 때문에 보통은 음이온의 측정에 이용한다. 하지만, 양이온 분석 용 IC가 없는 것은 아니다.[1] 이온 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피, 아미노산 전용 분석기 등등 수없이 많다.[2] 분해능, Resolution[3] N, Theorical Plate Number[4] 레진[5] trifluoroacetic acid 등등[6] 만약 크로마토그램 뒤쪽의 peak에 문제가 생긴다면 단순히 유량을 높이거나 분석 시간을 늘리는 방법밖에 할 수 있는 게 없다. 심지어 효율도 그닥 좋지 못하다.[7] 단순히 펌프를 isocratic에서 quaternary로 바꿨을 뿐인데 가격이 800만원씩 훌쩍 뛰는 경우도 많다.[8] 보통 polysaccharide